DNA 旋转酶是一种不一样的拓扑异构酶，因为它是能够催化 DNA 负超螺旋的酶。该过程依赖于 ATP，通过双链 DNA 的切割和重新连接以 2 步进行。

有关该反应的概述，请参阅：McKie ,  SJ 、  Neuman,  KC和 Maxwell,  A.  ( 2021 )。DNA 拓扑异构酶：通过结构功能分析进一步了解细胞作用和多蛋白复合物。BioEssays  ，  43 ，e2000286。

典型反应如下：

将 1 U DNA 促旋酶与 0.5 µg 松弛 pBR322 DNA 在 30 µl 反应体系中在 1X 检测缓冲液中于 37°C 下孵育 30 分钟

通过添加 30 µl 氯仿/异戊醇 (24/1) 和 30 µl 终止缓冲液 (STEB：40% 蔗糖、100 mM Tris.HCl (pH 7.5)、100 mM EDTA、0.5 mg/ml 溴酚蓝) 来终止每个反应，然后将其加载到琼脂糖凝胶上。(0.8%-1.0%：w/v)

凝胶可以在 TBE（90 mM Tris.Borate、2 mM EDTA）或 TAE（40 mM Tris.Acetate、2 mM EDTA）中运行，但如果在 TAE 中以最高 90V 运行 2 - 3 小时，超螺旋 pBR322 的分辨率会好得多。

典型凝胶：

所用的 DNA 底物（本例中为松弛的 pBR322）通常由琼脂糖凝胶上的一系列条带组成。这些条带是拓扑异构体（具有不同连接数的 DNA）。

用 DNA 促旋酶处理松弛的 pBR322 可将松弛的拓扑异构体转化为质粒的超螺旋形式，后者在琼脂糖凝胶上迁移速度更快。还可以看到上部条带，这是开环（有缺口）DNA，它存在于松弛的基质中，但与一些松弛的拓扑异构体一起迁移。

嵌入剂

如果凝胶槽中存在溴化乙锭或氯喹等污染物，则检测可能会出现问题。这些化学物质是嵌入剂，会影响 DNA 的移动性，导致结果混乱。如果缓冲液中存在嵌入剂，则松弛的拓扑异构体会提高移动性，并大致在与负超螺旋质粒相同的位置运行。根据嵌入剂的量，负超螺旋 DNA 的移动性可能略低于正常水平。

核酸酶

如果检测中存在污染性核酸酶（由于检测缓冲液被污染或细胞表达的不纯级分），切口可能会显著增加，从而导致开环 DNA 的数量增加，并可能产生线性 DNA。这在 OC 和 SC 之间以单一带的形式运行。

ATP

之前活性酶的活性丧失可能是由于缓冲液中 ATP 的劣化所致，尽管 5X 检测缓冲液已被开发以尽量减少这种情况。如果发生活性丧失，则在反应中添加额外的 ATP 将克服该问题。

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