EnGen SpRY Cas9 核酸酶是来自 S. pyogenes的 Cas9 核酸酶的变体，其 PAM 作用结构域内有几个点突变（1）。与野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在体外应用中可以在任意三核苷酸序列上游进行双链切割。

EnGen® SpRY Cas9 切割灵活性的演示。A）pXba 的示意图，显示了限制性内切酶 BsrGI 识别位点。矩形框中包含了 BsrGI 识别序列，红色三角形表示切割位点。B）用于靶向 pXba 中 BsrGI 位点的三个 sgRNA 序列。EnGen SpRY Cas9 和 BsrGI 的切割位点均以红色三角指示。SpRY Cas9 非经典 PAMs 以黄色文本表示。C）在 1X NEBuffer r3.1 中，使用 10 units BsrGI 或 1µM EnGen SpRY Cas9 和上述三种 sgRNA（浓度均为1µM）消化 1µg pXba 质粒（22563 bp）。所有反应在 37°C下温育 1 小时，然后在 80°C下温育 5 分钟。通过使用 Agilent gDNA ScreenTape 系统在 4200 TapeStation 仪器上进行凝胶电泳，以比较 BsrGI 和 SpRY 消化后产物 DNA 条带。针对 pXba 质粒的 BsrGI 位点进行定点切割， BsrGI 和 SpRYCas9 切割产生了几乎一致的条带图谱。使用浓度低至 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 sgRNA对 1µg pXba 质粒进行消化，结果与浓度 1 µM 的相似。未酶切的 pXba 作为对照进行电泳，但是环状 DNA 在 gDNA ScreenTape 系统中电泳不能精确地按大小进行分离。

在 1X NEBuffer™ r3.1 中，使用 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 50 nM 的 sgRNA，在37°C下反应 1 小时，将 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII ORF 起始密码子的下游进行线性化。在继续 DNA 组装之前，线性化质粒可以选择经过柱纯化或不纯化。按照推荐方案，使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装试剂盒将编码核定位信号（NLS）标签的寡核苷酸插入到pVII中。通过转化后生长的克隆数量，可以定性评估在 EnGen SpRY Cas9 消化质粒后，有多少转化子来自未消化的质粒。虽然不是必需的，但在组装前对线性化的 pXba 质粒进行纯化可以减少背景菌落百分比。