今天将为大家介绍的是手工细胞计数法。因为在细胞培养技术中，细胞计数应是一项基本功，对于标准化培养条件以及需要精确定量的实验来说都非常关键。

下面即是手工细胞计数的基本流程、原理和意义：

1.计数前首先准备好细胞计数器（血球计数板）：

使用70%乙醇将盖玻片和细胞计数板清洁、晾干备用。
将晾干的盖玻片轻轻覆盖至血细胞计数器上。

（注：使用前须保证盖玻片和计数板已充分晾干，否则将影响后续细胞充池及计数结果。）

2.制备细胞悬液：

对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落。（悬浮细胞则无需消化，稀释到合适倍数即可。）

然后加入适当的含血清培养基，中和胰酶的作用并重悬细胞，以得到均质的细胞悬液。要求尽可能将细胞吹散，不要残留任何细胞团，但不可用力过大。

（注：消化太过或消化不全均会使计数结果产生偏差。）

台盼兰染色（可选）：
如果需要计算细胞的活率，则需要将细胞悬液和0.4%台盼兰等体积混合；

室温孵育3-5分钟（悬浮细胞染色时间可视情况适当延长），使台盼兰全部进入死细胞，使死细胞着蓝色。

3.充池：即血细胞计数器加样

使用吸管或移液器将细胞悬液或细胞/台盼兰混合液滴加到计数池的边缘。此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池，此即为充池。

（注：若需进行多个样品的计数，应尽量保证每次充池的体积一致，一般在10μl/池左右。）

以同样的方式在另一侧的计数池中也加入计数样品。

将计数板静置几分钟使细胞扩散、沉降。

4. 细胞计数：

在100倍显微镜下，移动计数板将视野对准计数板的中央大方块，该方块四周有一圈3条平行线包围，中间有密集的网格。中央方块区差不多刚好可以填满整个视野（图1中标记的3号位置）。

                     图1.细胞计数板图解

分别计数大方格1.2.4.5中的细胞数。（为降低计数误差，最好将细胞浓度调整为20-50个/大方格。）并重复记录另一侧计数池中的细胞数，总计8个大方块，然后取均值。

计数原则为：“数上不数下，数左不数右"。（判断标准为是否接触三条边线的中间线，如图2所示）。

                                      图2. 细胞计数原则

如果有多个细胞没有吹散而成团存在，此时只可记为一个细胞。如果团块很多，则需重新吹打甚至重新取样消化直至绝大多数细胞为单个细胞。

5. 细胞浓度计算：

                                             图3. 样品充池体积图解

由图3可以得出，每个大方格的容积为：

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每个大方格的容积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需乘以104。

在常规没有使用台盼兰染色时，可以以下面公式计算每毫升样品中细胞的个数：
每毫升样品中细胞的个数 = 每个大方格内细胞的平均数 × 细胞稀释倍数×104

如果使用了台盼兰染色，还需要计算活细胞的百分率：
活细胞百分率（%）= 台盼兰拒染细胞数/总细胞数×100

此时活细胞数的计算公式为：
每毫升样品中活细胞的个数 = 每个大方格中细胞的平均数×活细胞比率×细胞稀释倍数×2×104
注：乘2是由于在台盼兰染色时，进行了等体积混合，相当于稀释了一倍。

看了以上步骤和原理，大家不禁会问：我们为什么要数细胞啊？细胞计数究竟有什么意义呢？其实，当我们想了解细胞的生长情况时，除了直接观察细胞形态以外，绘制细胞生长曲线、计算细胞倍增时间应该就是广泛采用的评价指标了。

所以尽管使用血细胞计数板手工计数细胞过程十分繁琐，对实验者操作者的要求也比较严格，现在也已有很多自动化的细胞计数器/仪，但对于科学研究中遇到的各种细胞而言，手工计数仍然是易行的方法而被广大实验室采用。

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